PCR这么多应用，你知道几个？

可能有的童鞋对PCR不屑一顾,“啥？PCR？不就是Polymerase Chain Reaction,不就是聚合酶链式反应嘛,什么巢氏PCR、Q-PCR,哥都做过,so easy！”,其实PCR也有很多拓展应用,上面的几个只是其中之一而已。(文章最后的选择题,你敢选吗？)

（一）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）

老生常谈,也为了照顾一下可能对PCR只知道皮毛的童鞋,咱们从PCR的祖坟开始刨。

PCR能够在体外进行DNA复制,微量的DNA经过PCR扩增后,DNA片段的量将大幅增加。无论是化石中的古生物、历史人物的残骸,还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大。这也是“微量证据”的威力之所在。

1)       标准的PCR反应体系中应该包含：buffer反应液、DNA聚合酶、镁钾离子、4种脱氧核糖核酸(A、T、C、G)、1对引物、DNA片段模板。

2)       反应条件：①加热94℃,DNA模板解链②退火到45~55℃③72℃延伸。

PCR的过程中目的DNA片段的增加数量符合以下理论公式：

                               Y(目的片段)=M*2＾n

                                                  (Y：目的DNA片段总数)

                                                                 (M：样本起始DNA模板数)

                                                                 (n: PCR循环数)

例如,模板共有100个,那么30轮循环后,将有100*2＾30=107,374,182,400个目的片段。

那么为什么是这样计算呢？PCR的原理童鞋们可以直接点击视频观看,更加形象生动,比X师兄打字儿强多了。

（二）Kary·Mullis其人其事

发明PCR技术的人想必有些童鞋是知道的,但是未必知道其人其事,这人叫Kary·Mullis

1979年,已经在加州大学做了7年博后的Mullis始终没有评上高级职称，最终厌倦了那里生活,出来找工作了,当年他进入了Cetus公司,一家做DNA疫苗、DNA诊断的公司,进入了核酸合成办公室,刚开始Mullis非常勤奋,肯干,但是不就又开始厌倦了,大量的重复劳动让他苦不堪言,终于81年他当上了办公室主任,也算是小领导了,终于可以轻松一点了。

 1983年七叶树花开的季节,Mullis在去乡下的路上,随着自己的车子在公路上一路驰骋,像极了延伸中的DNA链,突发奇想PCR的雏形。

不久,穆利斯正式作一个关PCR原理的学术报告,几乎没有人相信。

但是Mullis自己尝试试验,采用“撞大运”的方式进行了世界上第一次PCR实验,编号PCR 01,没有成功。10月,进行了PCR 02号实验,依然没有成功。

几周后,Cetus公司开会讨论是否开除穆利斯。因为他的创新性想法几乎没有实现,在公司制造混乱,与实验室其他雇员发生性关系,拿枪威胁与他女朋友约会的同事,等等。可是可是,公司最终决定,还是留下穆利斯,成立PCR组,给他一年时间完成PCR技术开发任务,否则say goodbye。

1984年11月15日,PCR实验获得了成功,那么接下来就是申请专利投稿了。一篇正式介绍PCR的原理的论文送到《自然》杂志,拒稿。所有作者都感到震惊,重投给《科学》,仍拒稿。最后只好改投吴瑞为主编的《酶学方法》杂志（这么伟大的发明居然Science不接收？这也没啥,当年Science也没接收X师兄的文章呢）。4年后,霍夫曼－拉夫什公司出资3亿美元购买PCR技术,而Cetus公司却倒闭了,费解。

拿到花不完的专利费后,Mullis就开始享受生活了,在老家买了一块牧场,做起了农场主,从此过上了幸福的日子。

这个故事告诉我们：这么伟大的发现你Science不接收？我们还不想投呢,让你后悔去吧。

（三）PCR仪出现前的PCR实验

众所周知,PCR的温度过程是变性（95℃）→退火（45~55℃）→延伸（70~75℃）的反复循环,切换的时候时间也很短,几十秒~2分钟的范围,这个就是PCR扩增仪的主要工作原理。

听我导师讲,他们以前在国外读博后,那时还没有PCR扩增仪,他们做PCR扩增时的工具只有一把镊子、一台多孔水浴锅外加一个计时器。发挥一下你的想象,为了做一次DNA扩增实验,计时器不断在叫,你的手时刻准备着冲刺,PCR的管子不断地在三个水浴槽之间跳跃,想想就很有画面感。

（四）PCR技术的扩展应用

原位PCR( in situ PCR)技术

原位PCR综合了PCR 和原位杂交(Insitu hybridization,ISH) 的优点,是一种在组织切片或细胞涂片上原位对特定的DNA或RNA进行扩增,再用特异性的探针原位杂交检测。

细胞膜和核膜有一定的通透性,PCR扩增所需的各种成分可进入细胞内或核内,在原位对特定的DNA或RNA进行扩增。扩增产物由于分子量较大或互相交织,不易透过细胞膜向外弥散,故保留在原位。

锚定PCR(Anchored PCR,APCR)技术

原理：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列,然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增,称为APCR。

应用：它可用于扩增未知或全知序列,如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。

不对称PCR(asymmetric PCR)技术

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度,常用50~100：1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA,但当低浓度引物被消耗尽后,高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。

应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

反转录PCR(reverse transcription,RT- PCR)技术

当扩增模板为RNA时,需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT-PCR应用非常广泛,无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

巢式PCR(NEST PCR)技术

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量,然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带,此为巢式PCR。

等位基因特异性PCR(Allele- specificPCR,ASPCR)技术

ASPCR依赖于引物3’- 端的一个碱基错配,不仅减少多聚酶的延伸效率,而且降低引物-模板复合物的热稳定性。

这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物,可用于检测基因点突变。

复合PCR(multiplex PCR)技术

原理：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。

应用：复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。

重组PCR技术

重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中,两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。

定量PCR(quantitative PCR,qPCR)技术

这个也是大家非常熟悉的方法了,qPCR可用于研究基因表达,能提供特定DNA基因表达水平的变化,在癌症、代谢紊乱及自身免疫性疾病的诊断和分析中很有价值。

竞争性PCR(competitive PCR,c-PCR)技术

c-PCR技术是竞争cDNA模板与目的cDNA同时扩增,使用同样的引物,但一经扩增后,能从这些目的cDNA区别开来。通常使用突变性竞争cDNA模板,其序列与目的cDNA序列相同,不过模板中仅有一个新内切位点或缺少内切位点。

这种方法能精确测定mRNA中cDNA靶序列,可用于几个到10个细胞中mRNA的定量。

（五）PCR之歌